AISLAMIENTO DE TRICHODERMA

Para el aislamiento de Trichoderma es necesario que el suelo recolectado incluya raíces y si es posible que se note la manifestación de dicho hongo;  una vez obtenido esto, se procede a tamizar el suelo para obtener 10 gr y al mismo tiempo separar algunas raíces para la preparación de 2 soluciones.

Solución 1: 

En un erlenmeyer se agregan 10 gr del suelo previamente tamizado y 90 mL de agua, a partir de esta solución se hacen 3 soluciones seriadas en una proporción de 1:10 (9 mL de agua y 1 mL de la solución 1, y así sucesivamente).

Solución 2: 

Las raíces previamente separadas, son cortadas en pedazos de 1 cm, hasta juntar 10-15, que luego son puestas en un erlenmeyer con agua, ajustando a 50 mL. Realizar igualmente 3 soluciones seriadas guardando la misma proporción.

Luego, de cada solución (diluciones de suelo y raíces), sacar 0.1 mL y en caja de petri que contengan PDA hacer un barrido con un asa de vidrio para que quede homogéneo lo que se siembra. Hacer dos repeticiones de cada solución seriada. 

 Siembra de cada una de las diluciones.                 

Debido a que el suelo recolectado viene de muestras mixtas y el PDA no es selectivo, es necesario agregarle algunos inhibidores como: 

• ácido láctico 85%: inhibe el desarrollo de bacterias por pH bajo. Se agregan 20 gotas/L del medio.
• ampicilina (antibiótico): Es de alto espectro e inhibe varias cosas. 0.25 g/L del medio. 

Medio de cultivo PDA.

Pasados 8 días se observó lo sembrado, para identificar microscópica y morfologicamente si Trichoderma se expresaba mejor en las muestras más, o menos diluidas; y según la fuente, si de suelo o raíz. 

Resultado de diluciones seriadas.

Esto con el propósito de seguir haciendo purificación. Para esto se tomaron las muestras mas diluidas de raíz y suelo para coger estructuras de Trichoderma (que se viera verde) y hacer una identificación en el microscopio y confirmar que si fuera el hongo de interes.

Estructuras de Trichoderma

Una vez confirmado se cogió del medio estructuras de Trichoderma y fue pasado a un medio fresco. Cuando finalmente creció sola, se conservó por medio de:

• crioconservacion
• papel filtro
• Agua destilada estéril

• CRIOCONSERVACIÓN: 

Se utiliza una solución con criopreservante (glicerol) y se añade 1 mL de agua + 0.1 mL de esporas y se conserva en eppendorf.

• PAPEL FILTRO: 

Solución saturada con partes de estructuras y se estima la concentración depende del caso. Se utiliza agua + esporas + papel filtro estéril y se almacena en eppendorf.

• AGUA DESTILADA:

Se suspende el hongo en agua destilada estéril en un eppendorf y al año se debe verificar que aún funcione.

EVALUACIÓN ANTAGÓNICA DE TRICHODERMA

Para evaluar la capacidad antagónica de Trichoderma obtenida en el laboratorio, se realizaron evaluaciones por medio de cultivo dual, metabolitos volátiles y en medio liquido.

• Cultivo dual: Para realizar esta evaluación previamente se sembró Fusarium proveniente de las siembras anteriores en las diluciones seriadas y Penicillium de una naranja esporulada; se enfrentó a cada uno contra Trichoderma, dándole prioridad a éstos a la hora de sembrar, debido a que Trichoderma coloniza mucho mas rápido.

Trichoderma vs Fusarium

Trichoderma vs Penicillium

• Metabolitos volátiles: Se realiza la siembra del patógeno en una caja de petri y Trichoderma en otra, sobreponiendolas y sellandolas para que nada se escape.

Trichoderma vs Fusarium

Trichoderma vs Penicillium

Control Penicillium

Control Fusarium